腸-肝類器官串聯(lián)共培養(yǎng)研究藥物吸收和毒性過程

為了彌補動物模型的局限性，提出了新的藥物安全性評估模型，以完善和減少現(xiàn)有的模型。為了在體外腸-肝臟的微生理系統(tǒng)（MPS）中模擬藥物的吸收和代謝，并預測藥代動力學和毒性效應，中國食品藥品檢定研究院安全評價研究所（國家藥物安全評價監(jiān)測中心），中國醫(yī)學科學院 & 北京協(xié)和醫(yī)學院，德國TissUse GmbH公司的科學家一起合作，建立了一個腸-肝臟串聯(lián)培養(yǎng)芯片，檢測了APAP（對乙酰氨基酚）過量后的急性肝臟損傷過程，并于2024年9月發(fā)表于《Food and Chemical Toxicology》雜志。

使用 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細胞系建立了腸類器官，同時利用 HepG2、HUVEC-T1 和經(jīng) PMA 誘導的 THP-1 以及人類肝臟星狀細胞建立了肝臟類器官。使用高效液相色譜法測定 APAP 濃度，并使用 Phoenix 軟件通過非房室分析法擬合藥代動力學參數(shù)。肝臟損傷生物標志物天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的變化，以及肝臟功能標志物白蛋白表明，這兩個器官芯片模型在 4 天內(nèi)的短期培養(yǎng)是穩(wěn)定的。在給藥對乙酰氨基酚（APAP）后，活性氧信號增強，同時線粒體膜電位降低，caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）被激活，p53 信號增強，表明 APAP 過量引發(fā)了毒性反應。在腸肝臟多器官系統(tǒng)模型中，我們擬合了毒代動力學參數(shù)，并模擬了 APAP 過量后的肝臟毒性過程，這將有助于器官芯片在藥物毒性檢測中的應用。

1. 引言

藥物性肝臟損傷（DILI）是藥物研發(fā)的主要障礙，會導致藥物撤市（2021 年；2016 年）。動物模型與人體之間的差異以及日益嚴格的倫理要求，使得有必要采用新的藥物安全性評估模型（2014 年）。這種微生理系統(tǒng)（MPS），也稱為“芯片上的器官”，是一種通過結(jié)合微流控、微制造和三維（3D）細胞培養(yǎng)構(gòu)建的裝置。它能夠為動物模型重現(xiàn)生理相關的器官功能。MPS平臺是一種微型化的體外生理環(huán)境（Shinohara等，2021）。

這使得能夠模擬和精確控制化學梯度和生物力學力，以模擬體內(nèi)環(huán)境并響應。預定義的微流控通道充當工程化的血管，重現(xiàn)體內(nèi)生理組織功能（Low 等，2020 年），并允許與其他多器官系統(tǒng)聯(lián)合（Kulthong 等，2020 年）。此外，多器官系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)實時組織功能監(jiān)測（Milani 等，2022 年）。

由微流道串聯(lián)的多器官芯片模型能夠進一步模擬人類動態(tài)反應和內(nèi)部器官相互作用（Arakawa 等，2020 年），并為藥物暴露與藥物效果/毒性的關系提供輔助證據(jù)。腸和肝臟是主要的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）器官，因此在藥代動力學（PK）研究中非常重要（Vernetti 等，2017 年）。

口服藥物通過消化道和腸直接吸收進入血液，影響藥物的生物利用度和全身劑量。腸芯片模型可以模擬藥物吸收，并描繪藥物的 ADME 和血藥濃度（Milani 等，2022 年）。Lee 等（2017 年）建立了一個三維腸肝臟芯片來描繪對乙酰氨基酚（APAP）的藥代動力學模型，而 Arakawa 等（2020 年）構(gòu)建了一個腸-肝臟模型，用于SAN唑侖的連續(xù)代謝的體外定量推算。Milani 等（2022 年）評估了由于腸和肝臟對麥考酚酯代謝而產(chǎn)生的藥物前體麥考酚酯的量。因此，類似的方法可以應用于其他多器官的 MPS，以研究人體內(nèi)的藥效學過程。

目前僅有少數(shù)關于同時進行毒性檢測和樣本鑒定的多器官芯片系統(tǒng)的例子被報道。Liu等（2020 年）基于基于腸、血管、肝臟和腎臟芯片的多器官芯片系統(tǒng)研究了人參皂苷復合物 K 的吸收、代謝和毒性。Jeon等（2021 年）報道了一種腸肝臟芯片，重現(xiàn)了脂肪酸的吸收以及隨后在肝臟中的脂質(zhì)積累。

為了探索體外腸-肝臟的微生理系統(tǒng)，在此，我們通過將腸培養(yǎng)物與使用四種細胞系構(gòu)建的 3D 肝臟球體串聯(lián)在二聯(lián)器官芯片（2OC）上，開發(fā)了一種可重復的腸-肝臟的二聯(lián)器官芯片。我們通過檢測功能生物標志物和蛋白質(zhì)的水平來剖析芯片功能，然后在芯片中通過向腸腔室添加肝臟毒性化合物對乙酰氨基酚（APAP）來測試肝臟毒性，以模擬藥物吸收后的肝臟毒性。經(jīng)過 48 小時的孵育，檢測了兩個腔室中的藥物分布和肝臟毒性信號。

2. 材料和方法

2.1. 細胞與培養(yǎng) 細胞資源及培養(yǎng)方法見補充信息。

2.2. 腸的培養(yǎng)

為了在 Transwell 培養(yǎng)板上構(gòu)建腸模型，以 1 ×10-6 細胞/孔的密度將 Caco-2 細胞接種到 Transwell 培養(yǎng)板（默克公司，PIHP01250）中。將 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細胞以 9:1 的比例混合，并以相同的濃度接種到每個培養(yǎng)板中。從第 0 天到第 7 天，每兩天更換一次培養(yǎng)基，第 7 天之后每天更換一次。

2.3. 3D（肝臟）的培養(yǎng)

基于我們之前的研究（Sun 等，2024 年），THP-1 細胞在 RPMI 1640 培養(yǎng)基中稀釋至 5 ×10-5 細胞/毫升，然后用 25 納摩爾的佛波酯酰基乙酸（PMA，MedChemExpress）處理 48 小時，在 6 孔板中進行。隨后在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 小時并用 TryplE（Gibco）進行篩選，經(jīng) PMA 誘導的 THP-1 細胞被收集。   2   HepG2、人臍靜脈內(nèi)皮細胞 T1、THP-1 以及人類肝臟星狀細胞（HHSC）消化后收集，細胞懸液以 60:19:15:6 的比例混合。為了形成等量細胞，稀釋后每孔接種 100 個細胞到圓底 U 型低貼壁 96 孔板（深圳肝臟生物技術有限公司，LV-ULA002-96UW）中。每兩天更換一半培養(yǎng)基。 使用高內(nèi)涵細胞成像分析儀（珀金埃爾默公司，Opretta 系列）對球形形態(tài)進行了觀察和測量。

2.4. 基于芯片的腸-肝臟共培養(yǎng)

HUMIMIC Chip2 24 孔板（德國 TissUse GmbH）是按照推薦方案（Wagner 等，2013 年）制備的。在腸模型建立后的第 14 天，將 Transwell 細胞嵌體添加到 24 孔培養(yǎng)室中，并將 50 個球體添加到 96 孔培養(yǎng)室中，以形成腸-肝臟芯片模型。

根據(jù)之前的方法（Lin 等，2020 年），在2OC 微流道循環(huán)中，使用600 ul循環(huán)培養(yǎng)基和 400 ul位于屏障頂部的培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)。

肝臟腔室中的培養(yǎng)基每天更換一次，并且收集并更換一半的循環(huán)上清液。在 7 天共培養(yǎng)結(jié)束時，使用免疫熒光法分析肝臟的器官特異性功能標志物。將片上微流泵設置為 0.8 Hz的頻率。

2.5. 腸類器官的完整性

在不同時間點測量熒光素鈉和 40 kDa熒光異硫氰酸熒光素 - 葡聚糖的跨內(nèi)皮電阻（TEER）和腸表觀通透性系數(shù)（Papp），以評估腸類器官的完整性。方法見補充信息。

2.6. 肝臟類器官的性能評估

在肝臟模型中，選擇了一種靈敏的雙色熒光細胞活力測定法來區(qū)分活細胞和死細胞。使用鈣黃綠熒光素 AM（一種細胞可滲透染料）作為活細胞指示物，使用碘化 BOBO-3（Invitrogen 公司）作為死細胞指示物。活細胞成分在活細胞中產(chǎn)生強烈、均勻的綠色熒光（激發(fā)/發(fā)射 488 納米/515 納米），而死細胞成分主要產(chǎn)生細胞核紅色熒光（激發(fā)/發(fā)射 570 納米/602 納米）。 在使用建立的肝臟器官芯片模型獲得的上清液中測量了各種生物標志物。我們評估了白蛋白（ALB）、尿素（UREA）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的水平，這些是肝臟代謝和損傷的指標。根據(jù)制造商的說明，使用 Cell Titor Glo 3D（Promega）測量了三磷酸腺苷（ATP）的含量。 膽酰基-賴氨酸-熒光素（CLF）是一種熒光素標記的膽汁酸，其生物學行為與天然膽酰基甘氨酸非常相似。為了在三維肝臟模型中可視化膽管，我們制備了 20 微摩爾的 CLF 儲備液，并將模型在 37°C 下孵育 2 小時。用 Hoechst 33342 染色并孵育 10 分鐘。細胞用無酚紅培養(yǎng)基沖洗三次，并在激發(fā)/發(fā)射波長為 498/517 納米處檢測熒光信號。

2.7. 形態(tài)學與免疫染色

如前所述（Sun 等，2024 年），腸和肝臟的等量切片用多聚甲醛固定，并用蔗糖溶液脫水。冷凍切片在染色前先用蘇木精-伊紅（HE）染色、高碘酸-希夫（PAS）染色或免疫染色進行切割。對于免疫染色，切片先用 PBS 沖洗三次     用含有 0.5% Triton X-100（索爾博）的 PBS 處理細胞，處理時間及穿孔處理 10 分鐘，用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封閉 30 分鐘，在室溫下進行。按照說明書以一定稀釋度向每個孔中加入一抗原位體，并在 4℃下孵育過夜。使用以下一抗原位體：抗 Occludin（91131S，CST，1:400 稀釋度）、抗 ZO-1（ab221547，Abcam，1:100 稀釋度）、抗 MRP2（ab172630，Abcam，1:500 稀釋度）和抗 PGP（貨號 25081-2-AP，ProteinTech，1:500 稀釋度）。清洗細胞，用相應的熒光偶聯(lián)二抗原位體處理，并與 DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用高內(nèi)涵細胞成像分析儀或顯微鏡（奧林巴斯 IX71）觀察明視野形態(tài)和切片。 對于原位免疫熒光染色，腸膜和 3D 肝臟模型用 PBS 沖洗三次，并用 4%多聚甲醛固定 30 分鐘。接下來，樣本在含有 0.5% Triton X-100（索爾博）的 PBS 中穿孔處理 10 分鐘，并在室溫下用山羊血清（Beyotime Biotechnology）封閉 30 分鐘。 按照說明書，將稀釋后的原位抗體以一定稀釋度加入每個孔中，并在4℃下孵育過夜。使用的原位抗體包括：抗Occludin（91131S，CST，1:400稀釋）、抗ZO-1（sc-33725，Santa Cruz Biotechnology，1:500稀釋）、抗MRP2（ab172630，Abcam，1:500稀釋）、抗ABCB11/BSEP（ab255605，Abcam，1:100稀釋）、抗PGP（Cat No. 25081-2-AP，ProteinTech，1:500稀釋）、抗CYP3A4（MA5-17064，ThermoFisher，1:1000稀釋）、抗Ki67（9449S，CST，1:10,000稀釋）、抗CD31（3528S，CST，1:100稀釋）、抗CD68（ab213363，Abcam，1:100稀釋）、抗SMA（14395-1-AP，ProteinTech，1:100稀釋）、抗裂解的caspase-3（9664S，CST，1:400稀釋）和抗p53（2524S，CST，1:2000稀釋）。細胞經(jīng)過洗滌，與熒光偶聯(lián)的次級抗體孵育，并與DAPI（Beyotime Biotechnology）共定位。使用的次級抗體包括：山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150077，Abcam，1:1,000稀釋）、山羊抗鼠IgG（H + L）（Alexa Fluor® 555 Conjugate）（4417，CST，1:1000稀釋）和山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor® 488）（ab150113，Abcam，1:1,000稀釋）。結(jié)果通過高含量分析和熒光顯微鏡進行評估。

2.8. 藥物毒性和細胞活力測定

如前所述（Sun 等，2024 年），使用 Cell Titor Glo 檢測細胞活力，并測定細胞存活率和細胞存活率（%）。在 96 孔板中，以 1 ×10-4細胞/孔的密度將細胞接種到 96 孔板中；次日丟棄上清液，并與對乙酰氨基酚（4 毫摩爾）一起培養(yǎng)。使用同樣的方法測定球體的存活率。該檢測使用光度計進行。

2.9. 阿司匹林在共培養(yǎng)芯片中的模擬口服過程

加載了 7 個 2OC 模型，其中 4 個微流道給藥對乙酰氨基酚（APAP），其余回路未給予。為了模擬口服過程以及 APAP 誘導的肝臟毒性后果，在加載 2OC 回路后的第二天，向插入物頂部加入 400 微升 10 毫摩爾的 APAP。在 0、0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小時分別收集 10 微升上清液用于液相色譜定量分析。在給藥 48 小時后，收集上清液用于各種生物標志物的測量以評估透皮電阻（TEER）。同時收集肝臟球體用于肝臟毒性評估。我們還至少收集了 3 - 5 個用于細胞活力測定，其余部分轉(zhuǎn)移到 96 孔板中保存以用于熒光染色。

2.10. 共培養(yǎng)芯片的肝臟毒性評估

根據(jù)推薦的試劑盒方案，測量細胞活力以及白蛋白（ALB）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平，以評估藥物給藥 48 小時后的肝臟損傷情況。使用線粒體膜電位檢測試劑盒（Beyotime Biotechnology，C2001S）進行測定線粒體膜電位。將 2OC 芯片的 3D 包埋肝臟模型轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。分別在 Ex/Em = 550/575 和 350/461 納米檢測四甲基羅丹明乙酯（TMRE）和 Hoechst 33342 的熒光信號。使用 CellROX 氧化應激試劑（賽默飛世爾科技，C10444）測定氧化應激。 將 2OC 芯片的 3D 嵌入式肝臟模型轉(zhuǎn)移到 96 孔板中。分別在 485/520 納米和 350/461 納米檢測 CellROX 和 Hoechst 33342 的熒光信號。使用免疫熒光染色法檢測原位 Ki-67、裂解的 caspase-3 和 p53 信號，以評估細胞增殖能力和細胞凋亡情況。

2.11. 樣本定量

基于之前的方法（Marin 等，2019 年），使用高效液相色譜法（HPLC）（島津，LC-2040C 3D）測量對乙酰氨基酚（APAP）的濃度。基底側(cè)腔室（肝臟腔室）用新鮮培養(yǎng)基填充，而頂側(cè)腔室暴露在對乙酰氨基酚培養(yǎng)基中。在每個時間點，如第 2.9 節(jié)所述，從兩側(cè)各取 10 微升樣本。選擇甲醇作為蛋白質(zhì)沉淀劑，在加入 30 微升甲醇以沉淀蛋白質(zhì)后，通過離心機（13000 轉(zhuǎn)/分鐘，4℃，15 分鐘）去除沉淀物。使用惰性可持續(xù) C18（150 毫米長度，內(nèi)徑 4.6 毫米，粒徑 5 微米，島津）色譜柱。使用兩種流動相：溶劑 A（甲醇）和溶劑 B（蒸餾水），流速為 0.8 毫升/分鐘。溶劑組成在 0 - 4 分鐘為 5% A，4.01 - 10 分鐘為 5 - 100% A，10.01 - 15 分鐘為 5% A。進樣量為 10 微升，檢測使用光電二極管陣列（PDA）檢測器（波長 280 納米）。使用標準曲線測定對乙酰氨基酚的濃度。 藥代動力學參數(shù)使用非房室模型（NCA）在 Phoenix WinNonlin（Certara，美國）中進行擬合。采用線性梯形線性插值法作為計算方法，模型類型定義為血漿，劑量選項定義為血管外。通過高效液相色譜法測定的肝臟隔室中的對乙酰氨基酚（APAP）濃度 - 時間數(shù)據(jù)進行擬合，以確定 0 至 48 小時下的曲線下面積（AUC）。峰值濃度（Cmax）和達峰時間（Tmax）直接從個體濃度與時間曲線中讀取（高等，2022 年；王等，2022 年）。 采用超高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS）檢測 NAPQI 的信號（張等，2018 年）。通過將 N-乙酰基對苯二酚亞胺（NAPQI）（MCE，HY-66005）溶解在甲醇中制備濃度為 1 毫克/毫升的儲備溶液，并用甲醇進一步稀釋至 1 微克/毫升的工作溶液。對 NAPQI 的形成進行了分析。 在服用對乙酰氨基酚（APAP）后 0.5、1、2、4、8、24、32 和 48 小時，使用配備 AB SCIEX LC AC 系統(tǒng)、PDA 檢測器和三重四極桿 6600+儀器的超高效液相色譜 - 質(zhì)譜法（UPLC-MS）進行檢測。通過使用沃特斯 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 毫米×50 毫米）實現(xiàn)了色譜分離。 1.7 微米）。使用的洗脫液為（A）0.1%（體積比）的甲酸水溶液和（B）甲醇，采用梯度洗脫程序進行分離，如表S1所示。超高效液相色譜流速為0.3 mL/min，超高效液相色譜-質(zhì)譜分析使用10 微升樣品。對應于解聚電位、碰撞能量、碰撞能量分布和溫度的離子對特征為m/z 149.98-108.04（30、30、15和350），對應于NAPQI。

2.12. 統(tǒng)計分析

連續(xù)變量以均值±偏差（標準差）表示。采用雙尾學生 t 檢驗來研究兩個獨立樣本之間的差異。數(shù)據(jù)分析使用 IBM SPSS Statistics 25 版（IBM 公司）進行。線性回歸模型使用 SPSS 和 GraphPad Prism 7.00（GraphPad 軟件）進行。統(tǒng)計學意義設定為 P≤0.05。

3. 結(jié)果

3.1. 類器官的培養(yǎng)

將細胞混合物以 1 ×10-6、5 ×10-5 和 2.5 ×10-5 個細胞/孔的密度接種到 Transwell 培養(yǎng)板中，以獲得體外腸模型。所有組的跨上皮電阻（TEER）在 21 天內(nèi)均達到 300 Ω cm2，其中高密度共培養(yǎng)組在 12 天內(nèi)達到 300 Ω cm2（圖 1A）。在第 14 天，高密度共培養(yǎng)組模型中熒光素鈉和熒光素葡聚糖均符合滲透性測試要求（圖 1B）。當跨上皮電阻達到 200 - 1000 Ω cm2 時，Caco - 2 單層可被視為完整（Iftikhar 等，2020 年）。在后續(xù)實驗中，選擇高密度共培養(yǎng)組來形成腸屏障。 緊密連接蛋白 Occludin 和 ZO-1 經(jīng)過染色，以顯示其在腸等值物培養(yǎng)條件下的完整性。在第 7 天和第 21 天，我們觀察到 Occludin 的連續(xù)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)（圖 1C），而在第 14 天和第 21 天的切片中，Occludin 和 ZO-1 呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖 1D，圖 S1A），表明在第 14 天腸屏障被視為完整的。在第 14 天和第 21    天，轉(zhuǎn)運蛋白 MRP2 和 PGP 分布在腸切片的一側(cè)（圖 1E，圖 S1B），表明腸模型的極性。總體而言，結(jié)果表明在第 14 天獲得的腸等值物具有緊密連接和極性；因此，在第 14 天腸屏障被視為成熟的，并用于進一步的實驗。 在圖 2A 中，模型的直徑在 10 天內(nèi)迅速增大，并穩(wěn)定在約 400 微米。HE 染色顯示在第 7 天（圖 2B）沒有明顯的壞死核心，但在第 10 天（圖 2B）有輕度壞死核心或幾個細胞凋亡，在第 14 天（圖 S1I）有嚴重的中心壞死區(qū)域。與活/死細胞染色（圖 2C）所示的死細胞分布一致，在第 10 天檢測到更多的死細胞。模型中 ATP 的總量持續(xù)增加（圖 S1C），而乳酸脫氫酶（LDH）的分泌沒有顯著增加（圖 S1D）。模型穩(wěn)定生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，壞死細胞數(shù)量增加，通過檢測上清液中的 LDH 水平無法檢測到內(nèi)部壞死細胞。為避免壞死細胞核的形成，這些結(jié)果表明培養(yǎng)時間限制為 7 天。 在第 7 天（圖 2D）和第 10 天，分別通過 CD31、CD68 和α-SMA 信號來追蹤人臍靜脈內(nèi)皮細胞 T1（HUVEC-T1）、人肺泡巨噬細胞 THP-1 和人肝臟星狀細胞 HHSC 的熒光信號，采用免疫熒光染色法進行追蹤。

圖 S1G 表明，上述三種細胞類型在第 10 天仍存在于球體中。在第 7 天檢測了轉(zhuǎn)運蛋白 MRP2、PGP 和 BSEP（圖 2E），并通過熒光探針 CLF 追蹤了膽汁酸外排的功能（圖 S1H）。CLF 是 MRP2 和 BSEP 的底物（Boaglio 等，2010 年），CLF 信號也表明了這些轉(zhuǎn)運蛋白在類器官中的功能。   最后，PAS 染色顯示有糖原沉積（圖 2B），ALB 和 UREA 的增加趨勢表明，即使在細胞死亡緊急情況下，肝臟的總合成代謝功能也未受阻礙（圖 S1E - F）。這些結(jié)果表明，在 14 天內(nèi)，類器官對肝臟功能的影響相對穩(wěn)定。  

3.2. 腸-肝臟芯片的建立及功能概況

在腸模型建立的第十四天，將腸和 50 個肝臟類器官分別裝入單獨的隔間，以形成腸-肝臟-芯片模型。相互連接的隔間使得液體能夠在通道和腔室中循環(huán)，促進了兩種類器官的共培養(yǎng)。 2OC 系統(tǒng)維持了7天。圖3總結(jié)了建立2OC模型后體外細胞活力以及腸和肝臟功   能。我們監(jiān)測了TEER水平（圖3A）以評估腸屏障的維持情況，盡管有波動，但TEER始終保持在300以上，表明即使與肝臟等量物共培養(yǎng)，腸屏障的完整性也得到了持續(xù)保持。在培養(yǎng)期間，測量了肝臟腔室中肝臟功能指標ALB（圖3B）和UREA（圖3C）的水平。ALB水平在前3天增加，然后下降，而UREA水平?jīng)]有顯著變化。此外，還評估了LDH、AST和ALT水平以確定腸和/或肝臟類器官的細胞活力（圖 3E 和 F）。兩個腔室的乳酸脫氫酶（LDH）水平略有升高，而隨著培養(yǎng)時間的延長，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平升高。這些結(jié)果表明 2OC 系統(tǒng)內(nèi)的功能和細胞活力發(fā)生了變化，表明盡管維持了腸類器官的完整性，但總體肝臟器官功能和細胞活力意外下降。 接下來，對從 2OC 芯片和 U 底 96 孔板獲得的肝臟類器官進行免疫染色信號的比較（圖 3G）。首先，在 U 底板培養(yǎng)時，主要觀察到 Ki67 信號沿球體邊緣分布，并且在球體內(nèi)部均勻分布，盡管在 2OC 芯片共培養(yǎng) 7 天后，其強度較弱。在 U 底板上培養(yǎng)時，沿肝臟球體邊緣的 PGP、MRP2 和 BSEP 信號更強，并且在球體內(nèi)部也能檢測到。在 2OC 芯片共培養(yǎng) 7 天后，觀察到沿邊緣有強烈的轉(zhuǎn)運蛋白信號，PGP 和 MRP2 的信號強度略強于在 U 底板培養(yǎng)的信號。最后，從兩種培養(yǎng)方法來看，細胞色素 P450（CYP）3A4 信號在球體中呈分散狀態(tài)，2OC 模型的信號略有增強。這些結(jié)果描述了肝臟類器官的基本功能，并表明在 2OC 芯片中的肝臟球體中 Ki67、PGP 和 MRP2 的表達與在 U 底板中的有所不同。

3.3. 在 2OC 二聯(lián)器官芯片中對過量對乙酰氨基酚的毒性評估

在對 2OC 芯片進行測試之前，將 HepG2 和 Caco-2 細胞暴露于不同濃度的對乙酰氨基酚（APAP）48 小時。當濃度超過 16 毫摩爾時，觀察到 Caco-2 細胞的存活率急劇下降（圖 S2A），而當 APAP 濃度   超過 2 毫摩爾時，HepG2 細胞的抑制率超過 20%（圖 S2A）。這些結(jié)果表明，在 2 - 16 毫摩爾的 APAP 范圍內(nèi)可能會產(chǎn)生強烈的肝臟毒性，但在 Caco-2 細胞中未檢測到明顯的毒性作用。在肝臟類器官中，當濃度超過 2.5 毫摩爾時，細胞存活率降至 80%以下（圖 S2B），用 4 毫摩爾的 APAP 處理 48 小時后，測得肝臟類器官的存活率為 70.69 ± 26.97%，與在 HepG2 細胞中觀察到的明顯毒性趨勢一致。 基于這些結(jié)果，選擇該劑量進行腸類器官的進一步測試。為了達到最終濃度為4 mM，從頂側(cè)施用10 mM的APAP，持續(xù)48小時，并測量存活率和TEER，以評估腸細胞的活力和屏障功能。與對照組相比，藥物施用后細胞活力沒有顯著下降（圖S2C）。盡管TEER顯示出下降趨勢（圖S2D），但仍保持在300 Ω cm2以上，符合腸屏障完整性的要求。這些結(jié)果表明，APAP對肝臟細胞具有明顯的細胞毒性，但在所檢測的濃度下不會損害腸的屏障功能。 在 2OC 芯片中，含有成熟腸類器官的頂部分室在濃度為 10 毫摩爾的阿司匹林（APAP）的條件下進行了添加。48 小時后，基底側(cè)室顯示每個球體有 83.94%的存活率，略高于 U 底板的存活率（70.69%）。盡管在跨上皮電阻（TEER）方面未發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖 4A）。 在這兩組之間，AST（圖 3B）（P < 0.05）和 ALT（圖 3C）水平與對照組相比呈上升趨勢，而治療 48 小時后 ALB 水平下降（圖 3D）。AST、ALT 和 ALB 反映了肝臟損傷，而 TEER 水平未反映腸道屏障損傷的嚴重情況。

最后，我們檢測到了 APAP 處理后熒光信號的變化。檢測到 Ki67 信號反映了細胞增殖能力的變化（圖 4E）。在對照組中，Ki67 信號主要集中在側(cè)面，并且在球體內(nèi)部觀察到散布信號。與對照組相比，治療后的 Ki67 信號在側(cè)面變得不顯著，信號主要集中在內(nèi)部，這可能是由于最外層細胞比內(nèi)部細胞更長時間暴露于對乙酰氨基酚（APAP），增強了對細胞增殖的抑制。接下來，檢測了 CellROX 水平，并且在 APAP 組中觀察到更強的信號（圖 4F）。在肝臟球體中觀察到 APAP 誘導的細胞凋亡，并且最初使用 TMRE 來評估線粒體膜電位（圖 4G）。在 APAP 組中，側(cè)面的信號強度降低，而對照組中信號分布更均勻，表明在給予 APAP 后，球體內(nèi)部側(cè)向細胞的線粒體膜電位降低。 在 2OC 芯片上孵育 48 小時后，急性胰腺炎（APAP）組中凋亡蛋白裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（圖 4H）和 p53（圖 4I）的表達顯示裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 信號更強，p53 信號略有增強。這些結(jié)果表明，在 2OC 芯片中孵育 48 小時后，可以檢測到急性胰腺炎誘導的肝臟球體增殖抑制、氧化應激和細胞凋亡。

3.4. 藥物在 2OC 二聯(lián)器官芯片中的吸收與代謝

圖5A、B展示了藥物濃度在各腔室隨時間的演變。在腸腔室中觀察到對乙酰氨基酚濃度迅速下降（圖5A），同時在肝臟腔室中檢測到的藥物濃度相應增加（圖5B）。在24小時時，腸和肝臟腔室中分別檢測到3.93 ±0.46 mM和3.68 ±0.41 mM的對乙酰氨基酚。盡管吸收過程易于觀察，但代謝過程并不容易模擬，這從對乙酰氨基酚濃度的不顯著下降可以看出，這可能是由于藥物劑量過大所致。即使藥物總濃度呈下降趨勢（圖5C），下降趨勢也不僅僅是由于采樣或藥物代謝。我們通過參考32小時測量的濃度計算了48小時無代謝的對乙酰氨基酚的理論總量。當沒有細胞代謝發(fā)生時，對乙酰氨基酚的量應該為3.16 ±0.53 mol；然而，實際檢測到的量為2.95 ±0.20 mol。這些結(jié)果表明，即使藥物過量，使用我們的2OC芯片也可以模擬藥物的吸收和代謝過程。接下來。我們檢測到了有毒代謝產(chǎn)物 NAPQI，在上清液中未檢測到該物質(zhì)。 為了精確描述 2OC 芯片中的藥物吸收過程，我們使用 NCA 模型計算了對乙酰氨基酚（APAP）的藥物吸收動力學參數(shù)。計算得出的 Tmax（達峰時間）、Cmax（峰值濃度）和 AUC（曲線下面積）分別為 24 ±11.31 h、3.98 ±0.59 mM 和 157.73 ±14.88 h mM。然而，由于 APAP 濃度下降極小，很難擬合藥物消除動力學參數(shù)。

4. 討論

本研究利用體外腸-肝臟多器官芯片平臺評估藥物吸收，并預測毒代動力學及其毒性作用。我們通過在 2OC 多器官芯片平臺上耦合兩個獨立器官構(gòu)建了一個腸-肝臟芯片系統(tǒng)，以重現(xiàn)口服對乙酰氨基酚（APAP）的連續(xù)藥物吸收以及隨之而來的急性肝臟損傷。在 2OC 系統(tǒng)中，APAP 的吸收率和毒性作用與已知的體內(nèi)處理過程一致。這些結(jié)果表明，在我們的 2OC 模型中可以模擬吸收過程，并且在存在上游腸器官的情況下，可以檢測到毒性作用，這與先前的報告一致。我們的發(fā)現(xiàn)為未來將多個器官耦合的多器官芯片模型作為輔助模型用于藥物毒性預測提供了支持。 基于人類小腸中腸上皮細胞與杯狀細胞的比例，使用 Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細胞進行腸構(gòu)建（Chen 等，2017 年；Tsamandouras 等，2017 年）。基于健康肝臟中細胞成分的比例創(chuàng)建肝臟球體（Weiler-Normann 和 Rehermann，2004 年）。基于先前的研究，我們在兩周的共培養(yǎng)中檢測了結(jié)構(gòu)和肝臟功能。HUVEC-T1 誘導的 THP-1 和 HHSC 的 CD31（Newman，1997 年）、CD68（Gao 等，2018 年）和α-SMA（Chiabotto 等，2021 年）標志物的信號表明了 10 天共培養(yǎng)后的細胞分布。慢性肝臟功能衰竭（CLF）的積累（Hopwood 等，2006 年）、轉(zhuǎn)運蛋白 MRP2、BSEP 和 PGP（Rendic，2021 年）以及白蛋白（ALB）和尿素（UREA）水平的增加（Baudy 等，2020 年）分別說明了膽汁轉(zhuǎn)運、藥物外排功能和合成代謝功能增強。慢性肝臟功能衰竭在 3D 球體的管狀結(jié)構(gòu)中積累（Ramaiahgari 等，2014 年），該信號表明在培養(yǎng) 7 天后形成了初步的管狀結(jié)構(gòu)。 我們基于我們的腸和肝臟類器官構(gòu)建了一個基于微流控裝置的腸-肝臟芯片（Marin 等，2019 年；Maschmeyer 等，2015 年）。其他腸-肝臟模型表明，器官表面積和代謝能力會影響口服藥物的吸收和代謝（Lee 等，2017 年）。使用天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）（Meunier 和 Larrey，2019 年）來評估肝臟毒性。3 天共培養(yǎng)后，其增加趨勢表明存在潛在的肝臟細胞損傷，而白蛋白（ALB）的減少趨勢可能是由于營養(yǎng)供應不足、藥物給藥、營養(yǎng)不良、蛋白質(zhì)攝入量減少以及肝臟損傷（Belinskaia 等，2020 年；Meunier 和 Larrey，2019 年）。 在本研究中，CYP3A4 信號略有增強，這與之前的研究結(jié)果一致，表明 CYP3A4 的活性在腸-肝臟共培養(yǎng)后得到增強（Chen 等，2018 年 b；Shinohara 等，2021 年）。

由于以往的研究主要關注腸-肝臟共培養(yǎng)后肝臟類器官代謝活動的增強（Shinohara 等，2021 年），我們重點關注轉(zhuǎn)運蛋白 MRP2、PGP 和 BSEP，它們介導外源性物質(zhì)從肝臟細胞的清除（Jetter 和 Kullak-Ublick，2020 年）。我們的結(jié)果清楚地表明，2OC 模型能夠模擬口服后有毒危害的吸收，并且上清液易于保存，以便用于人類生物標志物的監(jiān)測。

選擇該濃度的原因如下：1）在測試濃度下，腸屏障的完整性不會受損；2）該藥物對肝臟的毒性作用高于對腸的毒性作用。盡管對乙酰氨基酚（APAP）的吸收在很大程度上受胃排空的影響（Toes 等，2005 年），但它主要通過近端小腸的被動擴散被吸收（M′esza′ros等，2022 年）。在體外，高濃度的 APAP 已被證明會降低肝臟細胞活力（Bell 等，2020 年）。低劑量下，APAP 顯示出有限的毒性作用；然而，過量或濫用藥物時，APAP 會導致急性嚴重的肝臟細胞損傷（Bunchorntavakul 和 Reddy，2018 年）。隨著時間的推移，暴露濃度與毒性作用之間的關系可以解釋時間依賴性毒性的風險以及化學品的分子機制（Tennekes 和 Sánchez-Bayo，2013 年）。APAP 的濃度對于反映藥物暴露情況至關重要；因此，我們檢測了 APAP 的轉(zhuǎn)運情況（Bessems 和 Vermeulen，2001 年；Krenkel 等，2014 年；Makin 和 Williams，1996 年）。

對乙酰氨基酚（APAP）具有良好的口服生物利用度（88%），因為它能被良好吸收，在攝入后90分鐘內(nèi)達到血漿濃度峰值（Hodgman和Garrard，2012）。在我們的研究中，我們的2OC模型（24 ±11.31 h）中的Tmax預測值高于臨床數(shù)據(jù)（0.33-4 h）和其他2OC芯片的結(jié)果（6 h）（Marin等，2019）。APAP在治療劑量下吸收迅速，隨著劑量的增加而減緩（Rosenberg等，1981）。在治療劑量下，APAP的血漿半衰期在1.5到2.5小時之間；然而，我們檢測到24小時后兩個腔室的藥物濃度平衡，與之前的研究結(jié)果一致。Rawlins等（1977）測量了志愿者口服APAP（500、1000和2000毫克）后的血漿濃度，結(jié)果表明2000毫克時Tmax延遲。一些病例報告顯示，過量服用APAP制劑會導致血漿濃度峰值延遲和APAP吸收延長（Chiew等，2010；Graudins等，2010；Roberts和Buckley，2008）。Mazaleuskaya等（2015）總結(jié)說，由于APAP過量后代謝受損，半衰期延長至4-8小時。選擇了一種無腸毒性的肝臟毒性劑量，其給藥濃度（對乙酰氨基酚，4 毫摩爾，604.64 毫克/升）約為中毒血漿濃度（100 - 150 毫克/升）的四到六倍，以及昏迷致命血漿濃度（200 - 300 毫克/升）的二到三倍（Schulz 等，2020 年）。由于體外對乙酰氨基酚的毒性濃度（Bell 等，2020 年）遠遠超過人體的治療血漿濃度（5 - 25 毫克/升）（Schulz 等，2020 年），在我們的研究中，48 小時內(nèi)未觀察到明顯的藥物消除過程。藥代動力學（PK）的輔助證據(jù)表明，芯片模型需要進一步修改，特別是要進一步研究體外和臨床數(shù)據(jù)向臨床的轉(zhuǎn)換方法，以提高體外結(jié)果與臨床的相關性。

最后，我們檢測了我們的設備對肝臟球體細胞的毒性作用。與 96 孔板相比，2OC 芯片中球體細胞的存活率略有提高，具體反映了藥物毒性隨藥物濃度和時間暴露的變化。過量攝入對乙酰氨基酚（APAP）會顯著增加血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平（Acheampong 和 Thomas，2016；Stockman，2008）；然而，在 2OC 模型中暴露 48 小時后，AST 和 ALT 水平略有增加。同時，ALB 的下調(diào)表明肝臟的代謝功能受到抑制，并且發(fā)生了嚴重的肝臟損傷。這種下降與之前的一份報告（Wu 等，2022 年）一致。藥物遞送后，最外層細胞的Ki67（細胞分裂所必需的） 信號減弱，表明最外層細胞的增殖受到抑制。最初，我們在急性胰腺炎治療后檢測到受阻的肝臟球體。

在治療劑量下，對乙酰氨基酚主要通過葡萄糖醛酸化和硫酸化轉(zhuǎn)化為無毒代謝產(chǎn)物。對乙酰氨基酚被 CYP2E1 酶氧化并激活為有毒產(chǎn)物 N-乙酰天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（NAPQI）。NAPQI 耗盡谷胱甘肽（GSH）并將其轉(zhuǎn)化為對乙酰氨基酚半胱氨酸。當 GSH 低于正常水平的 30%時，NAPQI 不再被還原，引發(fā)毒性反應。盡管在動物血清和器官中可檢測到 NAPQI（Russomanno 等，2023 年；Zhang 等，2018 年），但除了在原代肝臟細胞中（Pingili 等，2019 年），在細胞系中檢測到這種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物仍然困難（Zhang 等，2020 年）。如前所述（Zhang 等，2020 年），只有少量的對乙酰氨基酚轉(zhuǎn)化為 NAPQI，其半衰期極短（Coles 等，1988 年；Madsen 等，2007 年）。它可以在 130 毫秒內(nèi)迅速且輕易地通過與 GSH 結(jié)合而被解毒（Coles 等，1988 年；Madsen 等，2007 年），或者通過 NADPH、二氫煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和還原酶還原回對乙酰氨基酚（Zhang 等，2020 年），因此在其體外模型中檢測 NAPQI 存在困難（Zhang 等，2020 年）。在谷胱甘肽（GSH）耗竭之后會發(fā)生 APAP 蛋白結(jié)合，這是肝臟毒性機制中的一個早期事件（Jaeschke 等，2014 年；McGill 等，2013 年）。作為一種替代的體外模型，GSH 耗竭（Leclerc 等，2015 年）、氧化能力（Geib 等，2021 年；Leclerc 等，2015 年）、共價蛋白結(jié)合（Geib 等，2019 年、2021 年；Pierce 等，2002 年）以及使用系統(tǒng)生物學模型獲取的體外毒性信息（Leclerc 等，2015 年），可能是追蹤或提示 NAPQI 形成和積累的替代方法。NAPQI 與線粒體蛋白結(jié)合以誘導蛋白質(zhì)酰化，這會導致肝臟細胞壞死或氧化應激以及線粒體功能障礙，最終導致細胞凋亡和肝臟損傷（Bessems 和 Vermeulen，2001 年；Krenkel 等，2014 年；Makin 和 Williams，1996 年；Saito 等，2010 年）。在急性胰腺炎（APAP）誘導的肝臟毒性發(fā)病過程中，肝臟細胞會出現(xiàn)線粒體功能障礙和氧化應激（Shan 等，2018 年；Ye 等，2018 年）。治療后，肝臟模型中TMRE信號的降低表明肝臟細胞（尤其是側(cè)細胞）的線粒體膜電位降低，線粒體功能受到影響。線粒體膜電位表示線粒體活性的變化和線粒體穩(wěn)態(tài)的破壞（Vianello等，2023）。在急性肝臟功能衰竭的早期階段，線粒體膜電位降低，導致線粒體形態(tài)變化并影響線粒體功能，這是肝臟細胞損傷的初始信號（Li等，2011；Umbaugh等，2021）。考慮到急性肝臟功能衰竭引起的氧化應激會損害蛋白質(zhì)折疊并觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（Ferret，2001；Ye等，2018），我們使用CellROX來定位活性氧信號，并在急性肝臟功能衰竭組中觀察到大量活性氧信號的分布。這些結(jié)果表明，使用2OC芯片模擬急性肝臟功能衰竭過量后，可以在肝臟模型中檢測到線粒體膜電位和細胞氧化應激的變化。

在急性肝臟功能衰竭的早期階段會發(fā)生肝臟細胞凋亡（Possamai 等，2013 年）。急性肝臟功能衰竭（APAP 誘導）會導致谷胱甘肽（GSH）耗竭，APAP 觸發(fā)線粒體毒性通路和過程，將半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3/7 前體轉(zhuǎn)化為活性裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Baek 等，2016 年）。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 - 3 是細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者，其前體酶形式在轉(zhuǎn)化為活性形式之前會被裂解（Fernandes-Alnemri 等，1994 年）。腫瘤抑制基因 p53 通過轉(zhuǎn)錄激活來調(diào)節(jié)細胞凋亡（Arakawa，2005 年）。APAP 誘導的肝臟毒性可能導致 p53 的輕微上調(diào)（Chen 等，2018a）。APAP 給藥后，裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 - 3 蛋白信號顯著增加，p53 信號略有增強，表明 APAP 誘導了細胞凋亡信號。

然而，不可否認的是，動物模型為現(xiàn)代醫(yī)學的理解和進步做出了重大貢獻，尤其是在過去幾十年中，對于藥物和化學品的安全性評估而言，這可能是替代性體外模型無法取代的。盡管這些新模型已經(jīng)并將繼續(xù)在生物醫(yī)學和監(jiān)管研究中發(fā)揮重要作用，允許對一種物質(zhì)的系列影響進行研究，并提供高靈敏度，不受其他生物現(xiàn)象的干擾（Kaplan 等，2024 年）。另一方面，應當強調(diào)的是，2OC 模型肯定還無法取代現(xiàn)有的生物模型，而是作為一種研究工具，提前提供特定的見解，以減少藥物篩選所需的動物數(shù)量。我們的結(jié)果表明，2OC 模型可以使用熒光探針測量藥物吸收并檢測與多種毒性相關的信號變化，展示了多器官芯片作為輔助證據(jù)同時檢測藥物療效/毒性和藥代動力學潛力的可能性。

5. 結(jié)論

我們建立了一個腸-肝臟二聯(lián)器官芯片系統(tǒng)，并通過模擬過量對乙酰氨基酚（APAP）后的急性肝臟損傷過程來評估其毒性作用。通過共培養(yǎng) Caco-2 和 HT29-MTX-E12 細胞建立了腸類器官，并用 HepG2、HUVEC-T1、PMA 誘導的 THP-1 細胞和 HHSC 建立了肝臟球體類器官。在多器官芯片組中，肝臟類器官中 PGP、MRP2 和 CYP3A4 的表達略有改善。在獲得兩個腔室中 APAP 的濃度-時間曲線后，使用 NCA 法擬合毒代動力學參數(shù) Tmax、Cmax 和 AUC。APAP 處理增加了肝臟毒性生物標志物 AST 和 ALT 的水平，減少了白蛋白（ALB）的分泌，抑制了細胞增殖，增強了活性氧（ROS）信號，降低了線粒體膜電位，激活了 caspase-3，并增強了 p53 信號。本研究為器官芯片在藥物毒性研究中的應用提供了輔助證據(jù)，同時檢測藥物含量和毒性反應，為預測候選化合物的藥代動力學和毒理學特性提供了潛力。